التعبير الجيني لالنزيم البشري المركب Glucocerebrosidase في دوار الشمس
الملخص العربي
تعد الزراعة الجزيئية واحدة من أهم تجارب التقنيه الحيويه النتاج محاصيل نباتية معدلة وراثيا إلنتاج بروتينات طبية وان بكتريا
Agrobacterium واحدة من أدوات الهندسة الوراثية التي تستخدم الدخال الجينات المرغوبه داخل النبات. في السنوات األخيرة زادت الحاجه
إلنتاج بروتينات عالجيه بطرق الهندسة الوراثية، ويعد انزيم الــ Glucocerebrosidase المستخدم لعالج المرض الوراثي Gaucher
disease واحد من تلك البروتينات. في الدراسة الحاليه تم تصميم بادئات خاصة لتضخيم الجين البشري GBA1-Hu المسؤل عن انتاج انزيم
Glucocerebrosidase من البالزميد المركب GBA-pGEM بعدها تم كلونه الجين المضخم في ناقل التعبير النباتي pCAMBIA1304
للحصول على ناقل كلونة يحمل الصفه الوراثيه لتشفير انزيم Glucocerebrosidase .استخدام البالزميد المركب الناتج
GBA-pCAMBIA1304 لتحويل بكتريا LBA4404 tumefaciens Agrobacterium الى بكتريا حامله للبالزميد المركب. اكدت
النتائج الحصول على بكتريا محورة وراثيا حامله للجين البشري GBA1 بواسطةPCR Colony . علقت بكتريا Agrobacterium
المحوره في وسط (IM (Medium Infection الحاوي على200 ميليموالرمن acetosyringone واستخدم هذا العالق لتحويل فلقات نبات
دوار الشمس الى فلقات محورة وراثيا حاوية على الجين البشري GBA1 ، اذ نميت الفلقات الحاوية على العالق البكتيري في الوسط الزرعي
)CCM Medium Cultivation-Co )الخالي من المضادات مع 200 ميليموالرمن acetosyringone ، بعد ذلك تم نقل الفلقات إلى وسط
اختيار) (SM Medium Selection )يحتوي على 5.7 مليغرام / لتر من Hygromycin و 250 مليغرام / لترمن Cefotaxime والتي
نميت لمدة 14 يو ًما إضافية بدرجه حرارة25م⁰ لفترة 16 ساعة ضوء و8 ظالم .اذ تم بنجاح إستزراع نبات دوار الشمس من الفلقات
المحور وراثيا وقد ثبت وجود الجين GBA1-Hu في الحمض النووي للنبات المحور النامي بواسطه PCR حيث كانت نتيجة التظخيم
حزمة بقياس 1561زوج قاعدي. كما تم الكشف عن التعبير الجيني للـGBA1 في دوار الشمس المحور بواسطة الريال تايم PCR مقارنه
مع GBA1gene القياسي. استخدم االختبار المناعي المرتبط بالنزيم ELISA وباستخدام عدة المحاليل الجاهزة ) Human
Kit ELISA Glucosylceramide )لتحديد هوية االنزيم المنتج من البروتين الخام المستخلصه من النبات المحور وتحديد تركيزه ايضا،
حيث اوضحت النتائج ان تركيز انزيم glucocerebrosidase المستخلص من نبات دوار الشمس المحول بجين GBA1 هو45.0 نانوغرام/
م
الملخص الانجليزي
Molecular farming has become one of the most significant implementations of modern
biotechnology to generate modified plant crops to produce medicinal proteins. Agrobacterium is one plant
genetic engineering tool that integrates genes of interest inside a host plant. In recent years, the need to
produce recombinant proteins as therapeutics has growing rapidly, and human glucocerebrosidase is one of
the proteins that is need to treat disease. In this study, specific primers were designed to amplify Hu-GBA1
gene from constructed pGEM-GBA plasmid which was cloned into the plant expression vector
pCAMBIA1304. The generated recombinant pCAMBIA1304-GBA plasmid was used to transform A.
tumefaciens LBA4404 and applied for transformation of sunflower cotyledon explants. Colony PCR
technique was used to confirm the presence of Hu-GBA1 gene in transformed A. tumefaciens. Agrobacterium
containing pCAMBIA1304-GBA was suspended in Infection Medium (IM) supplement with 200 mM
acetosyringone. A bacterial suspension was used to transform sunflower cotyledons. After infection,
cotyledons were co-cultivated in Co-cultivation medium (CCM), supplied with 200 mM acetosyringone
without antibiotics. The cotyledons were then transferred to selection media containing 7.5 mg/L
Hygromycin and 250 mg/L Cefotaxime and grown for additional 14 days at 25℃ in photoperiod of 16h L/8h
D. The transformed sunflower cotyledons were successfully generated complete plant with used 6-
Benzylaminopurine and Naphthalene acetic acid as growth hormones. The presence of the Hu-GBA1 gene in
the genomic DNA of transgenic sunflower plant was proven by PCR as a band of 1561bp size. The GBA
mRNA expression in modified sunflowers was detected by qRT-PCR compared with control GBA mRNA.
Enzyme Linked Immunoassay was done on crude recombinant protein that extracted from transformed
sunflower using Human Glucosylceramide ELISA Kit, the Elisa test results confirmed the production of
recombinant glucocerebrosidase and the concentration of crude recombinant enzyme extracted from
transformed sunflower with GBA1 gene was 0.45 ng/µl
زينب طعمة خلف | zainab tuama khalaf | 1686