عنوان المقالة:كلونة أنزيم تحلل الخثرة المنتج من بكتريا Staphylococcus aureus الطافرة ودوره في التطبيقات الطبية Cloning of staphylokinase produced from mutant Staphylococcus aureus and its medical applications
الخلاصــــة
جمعت من مصادر سريرية مختلفة لأصابات الانسان تتضمن 280 (%56) من اللوزتين, 100 (%20) من الأنف, 40 (%80) من الأورام الخبيثة (سرطان الدم, سرطان المعدة, سرطان الطحال, سرطان الكلية, سرطان الكبد), 17 (%3.4) من الأدرار, 27 (%5.4) من الجلد, 36 (%7.2) من الدم, شخصت العينات أعتمادا على Vitek2-GP و الكشف الجزيئي للجين 16srRNA بأستخدام PCR. التطفير الكيميائي أنجز بوساطة تعريض بكتريا مقاومة للمثيسيلين ومقاومة للفانكومايسين (VRSA) و (MRSA) بتعريضها الى جرعات مختلفة من المطفرات الكيميائية hydroxyleamine في (10, 20, 30) ملغم/مل, acridine orange في (30, 40, 50, 60) ملغم/ مل و ethylemethanesulfonate في (0.001, 0.002, 0.003, 0.004, 0.1, 0.2) مل , نتائج تطفير خلايا البكتريا مع انتاج انزيم تحلل الخثرة عند استخدام المطفر الكيميائي HA في تركيز 10 ملغم مع 85 خلايا حية, والمطفرAO في 30 ملغم مع 75خلايا حية والمطفر الكيميائي EMS في 0.001و 0.002 مل مع 73 خلايا حية. التحليل الوراثي للجين sak للبكتريا الطافرة (VSSA) و(MSSA) انجز بوساطة PCR بأستخلاص DNA وتضخيم الجين sak من اجل تحديد اي العزلات تمتلك الجين المشفر لانزيم تحلل الخثرة, النتائج توضح ان جميع العزلات (100) عزلة تمتلك الجين بحجم ناتج الجين 492 زوج قاعدة مقارنة مع DNA ladder. تسلسل القواعد النتروجينية DNA sequencing قبل وبعد التطفير الكيميائي أنجز 20 عزلة تمتلك أنتاج عالي لأنزيم تحلل الخثرة تمت دراسته من خلال معرفة ترتيب القواعد النتروجينية مقارنة مع نفس الجين لبكتريا S. aureus (العزلة القياسية) المسجلة في NCBI/ BLAST بأستخدام برامج تحويل تسلسل النيوكليوتيد الى بروتين بأستخدام برنامج mega 6 program software, النتائج توضح هناك عديد من الطفرات بعض منها ادت الى تغير في الحامض الاميني من واحد الى اخر شملت Transversion و Transition, النتائج توضح تحول القاعدة النتروجينية من كوانين (G) الى ادنين (A) ادت الى التحول من حامض اميني كلايسين (Gly) الى سيرين (Ser), تم عمل شجرة تطورية للسلالات بأستخدام برنامج Spa-X gene sequences وتم تسجيل 6 سلالات في بنك الجينات الامريكي (NCBI) تحمل الرقم ID خاص لكل سلالة تشمل السلالة الاولى Strain 1 ID=MN907801.1 والسلالة الثانية Strain 2 ID=MN907802.1 والسلالة الثالثة Strain 3 ID=MN907803.1 والسلالة الرابعة Strain 4 ID=MN907804.1والسلالة الخامسة Strain 5 ID=MN907805.1 والسلالة السادسة Strain 6 ID=MN907806.1, تم رسم البروتين لأنزيم تحلل الخثرة بالشكل B-sheet و α-helix بأستخدام برنامج raptoxt software, ادى الى تحول الحامض الاميني من كلايسين (Gly) الى حامض الاميني سيرين (Ser) الذي يمتلك مجموعة هيدروكسيل فعالة. الخطوة الاولى للكلونة حصلت بوساطة الانزيمات القاطعة (Restriction enzyme) BamH1 والانزيم القاطع EcoR1لتقطيع DNA البكتريا وناقل الكلونة pET32a و M13 في موقع معين للحصول على نهايات متماسكة sticky ends. الخطوة الثانية من الكلونة شملت ارتباط القطع DNA المقطعة الحاملة للجين sak مع ناقل الكلونة pET32a و M13المقطع بنهايات sticky ends المتوافقة مع بعضها. الخطوة الثالثة من الكلونة هو التحول transformation الى الخلايا المؤهلة compentent cell هي E.coli (DH5𝞪) عزلة قياسية, النتائج توضح وجود تحول موجب 14 عزلة قادرة على النمو على وسط اكار البلازما الحاوي على 50 ملغم/مل من مضاد ampicillin كمعلم انتقاءي مع انتاج لأنزيم تحلل الخثرة بشكل عالي. تنقية الانزيم الهجين Recombinant staphylokinase من البكتريا المتحولة الهجينة E. coli (DH5𝞪) باستخدام تقنية ion exchange chromatography, النتائج توضح 14 عزلة متحولة كانت معبرة لأنزيم تحلل الخثرة staphylokinase بشكل عالي مقارنة قبل الكلونة. توصيف الانزيم Optimizationللظروف المثالية لأنتاج أنزيم تحلل الخثرة الهجين باستخدام محفزات مختلفة, درجات حرارة مختلفة, الاس الهيدروجيني بدرجات مختلفة, أوقات حضن مختلفة و اوساط زرعية مختلفة, النتائج أثبتت هناك تعبير جيني عالي للانزيم عند أضافة المحفز inducer IPTG في تركيز 100 ملغم/ مل في 37°c عند pH 7 على الوسط الزرعي mannitol salt agar وبأضافة 0.5% سكر كلكوز وفي فترة حضانة من 3-48 ساعة. تم دراسة فاعلية انزيم تحلل الخثرة خارج الجسم الحي In vitro في انابيب اختبار حاوية على خثرة دموية للانسان, من اجل تقدير فاعلية الانزيم في اذابة الخثرة thrombi, النتائج توضح اذابة الخثرة بعد اضافة الانزيم staphylokinase الى انابيب الاختبار الحاوية على الخثرة خلال ثواني من أضافة الانزيم بتراكيز مختلفة وهذا يثبت أن الانزيم كفوء وفعال في أذابة الخثرة المسببة للجل
Abstract
Summary
MRSA S. aureus at different doses of chemical mutagen including hydroxylamine (HA); acridine orange (AO) and ethylemethansulfonate (EMS) at different concentrations. Results of chemical mutagenesis increased the production of staphylokinase with hydroxylamine chemical mutagen in 10 mg with 85 viable cells, as well acridine orange (AO) increase production of staphylokinase in 30 mg with 75 viable cells and ethylemethansulfonate (EMS) in 0.001 ml, 0.002 ml with 73 viable cells. Genetic analysis of sak gene of the mutant VSSA and MSSA S. aureus was achieved by genotypic PCR after DNA extraction with amplification of sak gene mutant VSSA, MSSA S. aureus to determine that each isolate possess sak gene with high expression of staphylokinase. Results showed (100 isolates) of mutant VSSA and MSSA of S. aureus possess sak gene with approximatly 492 bp compared with DNA ladder Marker. DNA sequencing was done before and after chemical mutagenesis for 20 isolates that possess higher productivity of mutant fibrinolytic enzyme. Results of DNA sequencing exhibited many types of mutations leading to conversion of one amino acid into others including transversion, transition from glycin (Gly) into serine (Ser). Phylogenetic trees of strain was done by using Spa-x gene sequences at neighbor-joining trees of the strain there was 99% match with a strains compared with strain in America, Canada, Australia and France. It is approved to be novel strains and registered at NCBI, also the protein drawing for Beta-sheet and α-Helix was studied Strain carry ID in NCBI/ Gene Bank, converting nucleotide sequence to protein by Mega 6 program software. Protein drawing done by raptoxt software program. The first step of cloning conducted by the restriction enzymes BamH1 and EcoRI for cutting DNA and plasmid vectors pET32a and then using second cloning vector M13 (novel cloning vector) in specific site to grant sticky ends of digested fragment of DNA of the mutant S. aureus, ligated digested fragment of DNA mutant S. aureus (sak gene) with plasmid cloning vector with sticky ends that compatible with ends of sak gene. Transformed recombinant vector recombinant pET32a and M13 into E. coli DH5𝞪 standard strain showed positive transformants E. coli DH5𝞪 containing recombinant pET32a and M13) which was selected on plasma agar medium containing 50 mg/ ml of ampicillin as a selectable marker in 20 isolates. Result exhibited 14 isolates were able to grow in the presence of ampicillin and producing stapylokinase. Optimization of staphylokinase (thrombolytic enzyme) achieved by measuring optimum conditions for recombinant staphylokinase at different inducer, incubations temperatures, pH, various growth medium, different incubation periods and different concentrations of glucose. Results revealed that the optimum conditions in expression at 100 mg/ ml IPTG inducer, 37°C temperature, (7) pH on MaCconkey agar with 0.5% glucose, at optimum incubation period 3hr. to 48 hr. Purification of recombinant staphylokinase was performed from recombinant E. coli (DH5𝞪) by ion exchange and gel filtration chromatography for 14 transformants E. coli (DH5𝞪) expressed recombinant staphylokinase from mutant S.aureus. Study of fibrinolysis was achieved by thrombolytic enzyme in vitro within tubes containing blood clot (thrombi) to determine enzyme activity in vitro to hydrolyze thrombosis. Results showed that dissolved thrombosis after adding different volume of fibrinolytic enzyme through seconds. As comparsion for lysis of blood clot by using Aspirin, results exhibit dissolve clots after 6 hrs. with not completely while Staphylokinase is proven to be used as recombinant drug therapy for hydrolyze blood clot, thromboi through seconds. The objective of this study includes Cloning staphylokinase gene (sak gene) into E. coli to determine the highest production of mutant S. aureus and its role in medical applications.
Publication Date
11/3/2021
Publisher
Nebras Rada Mohammed
Volume No
Issue No
Keywords
Cloning, Genetic engineering, Protein engineering. Molecular Genetics
نبراس رضا محمد | Nebras Rada Mohammed | 18968