عنوان المقالة:التحري الجزيئي والتعبير الجيني لمضخات الدفق في بكتريا Pseudomonas aeruginosa متعددة المقاومة للمضادات الحيوية Molecular detection and Gene expression of Efflux Pumps in Multidrug resistance Pseudomonas aeruginosa
الخلاصة
جمعت 120 عزلة تعود لبكتريا Pseudomonas aeruginosa المقاومة للكولستين للمدة من /15 2014/9 لغاية /11/15 2014, من مصادر سريرية مختلفة شملت : 33عزلة من الأدرار , و25عزلة من الحروق , و25عزلة من القشع , و17عزلة من الجروح , و 12عزلة من الدم, و 5عزلات من الأذن , و 3 عزلات من أدوات قثطرة المجاري البولية.
أختبرت حساسية العزلات قيد الدراسة تجاه مضاد الكولستين بأستعمال طريقة الأقراص وأظهرت النتائج وجود 27 عزلة مقاومة للكولستين وبنسبة (%22.5) , أختبرت مقاومة60 عزلة (بضمنها العزلات المقاومة للكولستين ) تجاه إثناعشر مضادا من مجاميع مختلفة, وحددت حساسية العزلات ومقاومتها للمضادات المايكروبية بأعتماد قياس قطر منطقة التثبيط بالمليمتر حول أقراص المضادات المستعملة , أظهرت النتائج أن جميع العزلات المختبرة كانت مقاومة بشكل تام لمضادات Amoxicillin و Carbencillin بينما أبدت العزلات مقاومة لمضاداتGentamicin بنسبة %70 و %56.6 Tobramycin و Lomefloxacin %58.3وكانت المقاومة أقل لمضادات Aztreonam %18.3و Polymyxin B بنسبة %18.3 وتلتها المقاومة لمضادNorfloxacin %13.3و Levofloxacin %11.6 فيما كانت أقل نسبة مقاومة تجاه Ciprofloxacin الأقل مقاومة وبنسبة %8.3.
أختبرت قابلية (60) عزلة أعلاه على إنتاج أنزيم البروتييز وتكوين الغشاء الحيوي وأظهرت النتائج قابلية % 88.3 من العزلات 53) عزلة )على أنتاج أنزيم البروتييز, وكانت جميع العزلات المقاومة للكولستين منتجة لأنزيم البروتييز وبنسبة %100 , من جانب اخر كانت 43 عزلة (%71.7) منتجة طبقة لزجة قوية محددة بوساطة تكوين مستعمرات سوداء دلالة على تكوينها الغشاء الحيوي .
كشف عن وجود مضخات الدفق بين 60 عزلة من عزلات الدراسة ( منها 27 عزلة مقاومة لمضاد كولستين و 33 عزلة حساسة له) بأعتماد طريقة العجلة الخشبية Ethedium Bromide – Agar Cartwheel Method (EtBr CW) بأعتماد صبغة الأثيديوم برومايد كمؤشر للكشف عن مضخات الدفق , وأظهرت النتائج أن 46 عزلة (76.7%) من العزلات المختارة أعطت نتيجة موجبة للفحص أعلاه , ومن جانب اخر كانت جميع العزلات المقاومة للكولستين موجبة للفحص مما يدل على أمتلاكها لمضخات الدفق , أما بالنسبة للعزلات الحساسة للكولستين فكانت %33.3منها تملك مضخات دفق بالكشف المظهري .
أخضعت 32 عزلة (27 منها كانت مقاومة للكولستين) للكشف الجيني عن مضخات الدفق بأستعمال تقنية Conventional PCRللكشف عن مضخة الدفق MexAB-OprM (بالكشف عن جينات oprMو (mexAومضخة الدفق MexXY (بالكشف عن جين mexY) أظهرت النتائج أن20 عزلة (62.5%) تمتلك الجينoprM , و أن 22عزلة (68.8%) تمتلك الجين mexA , و24 عزلة (75%) تمتلك الجينmexY , وبينت النتائج أيضا بخصوص الكشف الجيني عن مضخات الدفق لعزلات الدراسة أن جميع العزلات الموجبة لأختبار أمتلاك الجين mexYهي مقاومة للكولستين وقد شكلت نسبة %88.9 من العزلات الكلية المقاومة للكولستين .
كشف عن التعبير الجيني لمضخة الدفق OprM-MexAB (بدراسة الجين (mexB ومضخة الدفق MexXY ( بدراسة الجين mexX) في 9 من عزلات الدراسة والتي كانت مقاومة لمضاد الكولستين بأستعمال تقنية q RT-PCR من خلال أستخلاص RNA البكتيري , ومن ثم تحويله الى cDNA , وأظهرت نتائج الكشف عن التعبير الجيني للجين mexB و الجين mexXأن العزلات كانت متباينة في قيم ct , وبحسب معادلة Livak وأستخرجت قيم ct ومعرفة التعبير الجيني لمضخات الدفق , ولوحظ أن التعبير الجيني لمضخة الدفق MexXY أكثر من التعبير الجيني لمضخة الدفق MexAB-OprM , وأن مضخة الدفق MexXY كان لها تعبير أعلى من مضخة الدفق MexAB-OprM التي كان تعبيرها صفر عند أضافة مضاد كولستين .
Abstract
Summary
A total of (120) clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa were collected from different sources , During the period between 15/9/2014 till 15/11/2014 . The source of these isolates were as follows : 33 isolates from urine , 25 isolates from Burns , 25 isolates from sputum , 17 isolates from Wounds , 12 isolates from Blood , 5 isolates from ears ,and the last 3 isolates from Catheters . All isolates were identified through morphological , cultural and some biochemical tests and using Vitek2 GN .
The antibiotic susceptibility test Towrd Colistin was done using the agar diffusion method ; Results showed that 27 isolates 22.5% were resistance to Colistin ,then Sixty isolates ( Ones 27 isolates resistance to Colistin ) were tested against twelve antibiotic by measuring inhibition zone around disk antibiotic , Result showed that All isolates were complete resistance to Amoxicillin and Carbencillin , While resistance to other antibiotic were Gentamycin 70% , Tobramycin 56.6% , Lomefloxacin 58.3% , and less resistance was showed for Aztreonam 18.3% , Polymyxin B 18.3%, Norfloxacin 13.3% , Levofloxacin 11.6% and Ciprofloxacin 8.3% ,The most effective antibiotic against Colistin resistance isolates were Levofloxacin and Ciprofloxacin .
Sixty of isolates were choosen to detect for ability to protease production and biofilm formation , The Results showed 53 isolates 88.3% were protease production , and results showed all Colistin resistant isolates were protease production and 43 isolates 71.7% were able to biofilm formation .
Sixity isolates (Ones 27 Colistin resistance isolates ) were choosen for detect efflux pumps by using Ethedium Bromide – Agar Cartwheel Method (EtBr CW) , which include ethedium bromide dye as marker to detect efflux pumps , the result showed that 46 isolates 76.7 % give positive result .
Polymerase Chain Reaction (PCR) technique was performed done using specific primer targeting the specific sequences of the mexA , mexY, oprM gene , The results showed that oprM found in 20 isolates 62.5% , mexA found in 22 isolates 68.8% , mexY found in 24 isolates 75% , The results also showed that 88.9 % from Colistin resistant isolates had mexY gene .
Detection of gene expression was performed done by using q RT-PCR technique after RNA extraction of Colistin resistant isolates and c DNA synthesis , The results showed that gene expression were high in efflux pumps especially to MexXY efflux pumps , and the gene expression to MexXY efflux pumps higher than MexAB-OprM efflux pums .
نبراس رضا محمد | Nebras Rada Mohammed | 19384